Décembre 2023
Applications principales
En Recherche: Recherche de mutations dans des panels larges ou des exomes complet) à visée de découverte.
En Clinique: Recherche de mutations dans des panels restreints pour le diagnostique.
Permet l’étude de mutations constitutionnelles et somatiques à faible pourcentages.
Un grand nombre de patients peuvent être analysés simultanément et rapidement.
L’analyse bioinformatique devient partie intégrante du processus de traitement.
But: recherche de mutations dans des gènes d’interêt pour poser un diagnostique sur un patient.
Etapes de l’analyse bioinformatique:
But: recherche de mutations dans des gènes d’intérêt pour poser un diagnostique sur un patient.
Etapes de l’analyse bioinformatique:
samtools view pour le lire)Ils contiennent les reads: petite séquence d’un fragment d’ADN de longueurs plus ou moins fixe.
@HWI-ST865:166:D0C4KACXX:2:1101:1042:1954 1:Y:0: CNANAAATNAANNNNGNNNNNNNNNANNNNNAAANNNTNNNNNNNNNTNNTGNNNNTTGTTTNNTTGTGGGTTTCTCTGTCCCCN + ##################################################################################### @HWI-ST865:166:D0C4KACXX:2:1101:1241:1970 1:N:0: CCAGCGACACTTGCAGCTTAGGGGCAAGAGGCTCCCACAACACCCTGTGCGATCGGAAGAGCGGTTCAGCAGGGATGCCGCGGCC + GFFIGIIIFGEHHIJJJIIGGGHIIBD=BFG?EDECC@FGCHC?BCCBB)53(;;B;?8299?######################
Quelques définitions:
Exemple:
Référence: Li et al: Fast and accurate short read alignment with Burrows–Wheeler transform. Bioinformatics. 2009 Jul 15; 25(14): 1754–1760.
BWA (Burrows-Wheeler Alignment tool)a été spécialement conçu pour l’alignement de millions de séquences peu divergentes d’un génome de référence.
Il est basé sur la Transformée Burrows-Wheeler associé à un algorithme de tri par arbre. Il permet l’alignement de reads relativement longs pour lesquels il existe des seuils (gap) en cas de présence d’INDELS.
Il utilise une quantité relativement faible de mémoire et est parallélisable, pour exploiter les architectures multi-coeurs.
Référence: Van der Auwera GA & O’Connor BD. (2020). Genomics in the Cloud: Using Docker, GATK, and WDL in Terra (1st Edition). O’Reilly Media.
Tutoriel: Van der Auwera GA et al. (2013). From FastQ Data to High-Confidence Variant Calls: The Genome Analysis Toolkit Best Practices Pipeline. Curr Protoc Bioinformatics, 43:11.10.1-11.10.33. DOI: 10.1002/0471250953.bi1110s43.
GATK est une suite d’outil qui permettent
Pipeline issu des bonnes pratiques définies par le Broad Institute.
Le format de fichier VCF (Variant Call Format) est typiquement utilisé pour l’échange de données. (Nous en sommes à le version 4.3) (https://samtools.github.io/hts-specs/VCFv4.3.pdf).
Ca format a été développé dans le cadre de large projets génomiques (1000 Genome Project). Certain sites ont développé leur propre spécification du format VCF.
Une en-tête (marquée avec des ##) contenant les métadonnées:
FILTER, INFO et FORMAT(Optionnel) La liste des régions du génome analysé (Format gVCF)
La liste des variants contenant:
##Entrées FILTER: Descripton du filtre utilisé pour le contrôle qualité
Entrées INFO: Informations sur l’ensemble des échantillons
Entrées FORMAT: Informations spécifique à chaque échantillon
C’est un fichier texte délimité par des tabulations. On peut donc l’ouvrir avec M$ Excel mais en général, nous travaillons sur ce type de fichiers avec des outils dédiés ou des scripts “maison” du fait de leur volume.
Voici quelques outils très intéressants pour la manipulation de fichiers VCF:
Il existe également un format étendu genomic VCF (gVCF), utilisé avec GATK, qui contient des informations sur les blocs qui correspondent à le référence et à leur qualité.
L’annotation des variants consiste à collecter de l’information biologique correspondant aux variant que l’on analyse.
Nous allons pouvoir savoir dans quel gène/exon se trouve la mutation et quel est son impact au regard de la protéine correspondante.
Nous allons pouvoir également trouver leur fréquence allélique dans les populations, que ce soit parmi la population générale our parmi des patients atteins de cancers ou maladies génétiques rares.
Il est égalent possible de contribuer nos découvertes dans des bases de données publiques.
Bien qu’il soit possible de parcourir manuellement les bases de données publiques, il est plus simple d’interroger directement les bases publiques avec des programmes spécialisés dans l’annotation. Par Exemple: Annovar, snpEff.
Annovar est un utilitaire d’annotations de variants. Il fonctionne à partir de génomes divers (hg38, hg19, souris, drosophile, levure, etc…)
Il permet de faire des annotations au niveau des gènes et donc de retrouver les gènes à partir des bases de données RefSeq, Ensembl, etc…
Il permet aussi d’annoter des Régions ainsi que de construire des filtres basés sur le contenu des bases de données.
Les principales bases de données qu’il permet d’utiliser pour l’annotation sont:
(voir https://annovar.openbioinformatics.org/en/latest/user-guide/filter/#summary-of-databases)
SnpEff permet de prédire l’effet d’un variant sur les gènes ou protéines (changement dans les acides aminés par exemple).
Référence: Cingolani P et al:, A program for annotating and predicting the effects of single nucleotide polymorphisms, SnpEff: SNPs in the genome of Drosophila melanogaster strain w1118; iso-2; iso-3.”. Fly (Austin). 2012 Apr-Jun;6(2):80-92. PMID: 22728672
La base de données Genome Aggregation Database est une base développée à l’intention de la communauté scientifique et médicale pour l’annotation de séquences humaines.
Elle contient les fréquences alléliques de variants strucuraux dans différentes populations pour plus de 76000 génomes (pour hg38) et 10000 génomes (pour hg37) ayant été séquencés dans le cadre d’analyses de maladies rares et de cancers.
Référence: Karczewski, K.J., Francioli, L.C., Tiao, G. et al. The mutational constraint spectrum quantified from variation in 141,456 humans. Nature 581, 434–443 (2020). https://doi.org/10.1038/s41586-020-2308-7
C’est un catalogue de variations génétiques communes (existantes dans au moins 1% de la population) obtenues à partir de donneurs sains, constituant une ressource de référence utilisée par la communauté biomédicale.
Ce catalogue est accessible à travers l’International Genome Sample Ressource.
Il est continuellement maintenu et mis à jour avec les dernières versions du génome humain et des données provenant de nouvelles populations.
A ce jour, il contient des variants pour 2504 individus obtenus dans 26 populations.
Il n’y a aucune donnée phénotypique ou médicales associée.
Référence: A global reference for human genetic variation, The 1000 Genomes Project Consortium, Nature 526, 68-74 (01 October 2015) doi:10.1038/nature15393.
URL: https://cancer.sanger.ac.uk/cosmic Cette base constitue une ressource pour l’exploration de l’impact des mutations somatiques dans les cancers.
Il contient des données traitées manuellement associées à des panels de gènes ciblés. Elles sont disponibles sur les versions hg37 et hg38 du génome humain.
Les données consistent en un catalogue de mutations liées à 1.4 millions de tumeurs obtenues à partir de 26000 publications. Les données sont associées à des meta-données (facteurs environnementaux et historique des patients).
Référence: COSMIC: the Catalogue Of Somatic Mutations In Cancer. John G Tate et al. Nucleic Acids Research, Volume 47, Issue D1, 08 January 2019, Pages D941–D947, https://doi.org/10.1093/nar/gky1015
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